靈芝多糖對小鼠腹腔巨噬細胞蛋白激酶A活性的影響

中草藥 2000年第5期第31卷 藥理實驗與臨床觀察

作者：李明春　梁東升　許自明　雷林生　楊淑琴　孫莉莎

單位：李明春 梁東升 許自明（中國人民解放軍401醫(yī)院藥劑科　青島 266071）；雷林生 楊淑琴 孫莉莎（第一軍醫(yī)大學藥理教研室）

關鍵詞：靈芝；靈芝多糖；巨噬細胞；蛋白激酶A

　　摘　要　為觀察靈芝多糖(GLB7)體外對小鼠腹腔巨噬細胞(MΦ)蛋白激酶A(PKA)活性的影響，采用反相離子對高效液相色譜法測定MΦ中RKA活力。結果表明GLB7(40 mg/L)能引起小鼠腹腔MΦ中PKA活性明顯升高，10 min達峰值，30 min恢復到基礎水平。提示靈芝多糖的免疫增強作用與其增強MΦ中PKA活性有關。

Effects of Ganoderma (Ganoderma lucidum) Polysaccharide on PKA Activity of

　　Murine Peritoneal Macrophages

　　Li Mingchun, Liang Dongsheng and Xu Ziming

　?。―epartment of Pharmacy, No.401 Hospital of PLA 　Qingdao 266071）

　　Lei Linsheng, Yang Shuqin and Sun Lisha

　?。―epartment of Pharmacology, the First Military Medical University）

　　Abstract　　To investigate the effects of Ganoderma lucidum polysaccharide (GLB7) on protein kinase A (PKA) activity of murine peritoneal macrophages. A new ionpair RP-HPLC method was used to determine the activty of PKA in cells. The results showed that GLB7 (40 mg/L) activated the PKA of murine peritoneal macrophages, to a peak value within 10 min, and then recovered to its basic level after 30 min. This result indicated that GLB7 may act as an immunopoteniator of PKA in murine peritoneal macrophages.

　　Key words　　Ganoderma lucidum (Leyee.ex Fr.) Karst　Ganoderma lucidum polysaccharide　macrophage　protein kinase A (PKA)

　　靈芝多糖是靈芝Ganoderma lucidum (Leyss. ex Fr.) Karst的主要活性成分。以往實驗證明靈芝多糖具有免疫增強和抗腫瘤作用，它能增強小鼠腹腔巨噬細胞(MΦ)的吞噬功能，促進混合淋巴細胞培養(yǎng)反應，促進未經(jīng)純化的脾細胞在體外的增殖，增強DNA多聚酶α的活性以及促進白細胞介素2的分泌等［1～4］。但靈芝多糖的免疫作用機制尤其是對免疫細胞的信號轉(zhuǎn)導過程有何影響尚不清楚。本文利用反相離子對高效液相色譜測定技術，觀察靈芝多糖對小鼠腹腔MΦ中蛋白激酶A(PKA)的影響，以探討靈芝多糖的免疫調(diào)節(jié)作用機制。

　　1　材料和方法

　　1.1　藥品與試劑：靈芝多糖(GLB7)，按文獻方法提?。?，6］，化學組成是以葡萄糖、半乳糖為主的雜多糖，糖苷鍵連接方式以β(1→4)為主，稍多α(1→6)，分子量9 000。RPMI-1640培養(yǎng)基，為Gibco產(chǎn)品。胎牛血清(FCS)：杭州四季青生物工程材料研究所產(chǎn)品。Sucrose、DTT、Leupetin、Histone (Ⅲ-s)、PM-SF、ATP、ADP、AMP、cAMP均為Sigma產(chǎn)品。甲醇、PiCA，皆為國產(chǎn)色譜純。

　　1.2　動物：BALB/c純系小鼠，?♀不限，8周齡，體重18～22 g，由第一軍醫(yī)大學實驗動物中心提供。

　　1.3　巨噬細胞的培養(yǎng)：按文獻方法［7］無菌取小鼠腹腔MΦ，經(jīng)苔盼藍染色細胞活率95%以上，調(diào)整細胞濃度為109～1010/L，接種于多孔培養(yǎng)板中，置于含5%CO2、95%空氣孵箱中，37 ℃孵育24 h。對照組皆以RPMI-1640完全培養(yǎng)基替代，實驗組中加測試藥物等處理因素皆以RPMI-1640完全培養(yǎng)基溶解和稀釋。

　　1.4　RKA活性測定［8］

　　1.4.1　PKA的制備：于培養(yǎng)的細胞體系中加入200 μL PKA提取液，內(nèi)含：Tris-HCl (pH7.4) 20 mmol/L, DTT 2 mmol/L, Leupetin 5 mg/L, PMSF 1 mmol/L, Sucrose 200 mmol/L, CaCl2 1 mmol/L, KCl 10 mmol/L, MgCl2 2 mmol/L。冰浴下超聲粉碎。900×g離心5 min，去除碎片和胞核，得上清即為胞漿組分和膜性組分，以此用于測定PKA總活力。以上操作皆于4 ℃以下進行。

　　1.4.2　PKA活性測定：用反相離子對高效液相色譜法測定［8］。色譜條件：C18柱；流動相：甲醇-磷酸鹽緩沖液(20∶80，pH7.0，內(nèi)含5 mmol/L PiCA)；流速：1 mL/min；檢測波長：259 nm；柱溫：室溫；0.01AUFS、進樣量20 μL。PKA反應體系中包括PKA反應液，內(nèi)含：Tris-HCl (pH7.4) 20 mmol/L, MgCl2 5 mmol/L,組蛋白(Histone,Ⅲ-s) 1 g/L, DTT 2 mmol/L, ATP 0.5 mmol/L, cAMP 2 μmol/L和適量酶液(按蛋白含量計)，反應總體積為1 mL。先將除酶液以外的其它溶液混勻，30 ℃預熱5 min，再加入酶液起始反應。反應開始后于30 ℃水浴搖床中準確保溫10 min，立即置于沸水浴中1 min終止反應；冷卻后離心除去蛋白沉淀，上清液中加入1 mL氯仿-甲醇(2∶1)混合物，振蕩1 min，抽提脂溶性物質(zhì)，200×g離心5 min；小心吸出水層，其中含ATP、ADP和AMP。重復前步驟處理1次，合并提取液，低溫凍存待測。

　　1.4.3　蛋白含量測定：按Lowry法測定。

　　1.4.4　PKA活力定義：一個酶活力單位相當于每分鐘使Histone (Ⅲ-s)磷酸化而消耗1 nmol ATP所需的酶量。

　　2　結果

　　2.1　反相離子對HPLC法測定PKA：在上述色譜條件下，ATP、ADP和AMP三種物質(zhì)可呈現(xiàn)良好的分離，在樣品測定中，雜質(zhì)峰不影響ATP的測定(圖1)。

A-標準品　　B-樣品

1　反相離子對HPLC法測定MΦ中PKA色譜圖

　　2.2　GLB7對小鼠MΦ中PKA活性的影響：以40 mg/L GLB7與MΦ一起孵育不同時間后，測定PKA總活力。結果顯示：GLB7可明顯增強小鼠腹腔MΦ中PKA總活力，10 min達到峰值，至30 min恢復到基礎水平(圖2)。在10 min時GLB7與PKA的量效關系具有一定濃度依賴性(r=0.878 9，表1)，實驗測得PKA的基礎總活力為(80.93±4.52) nmol/(min?mg)(n=6，±s)。

A-實驗組；　B-對照組；　GLB7濃度為40mg/L

2　GLB7對小鼠腹腔MΦ PKA活性的影響時程

表1　GLB7對小鼠MΦ PKA活性的影響(n=6，±s)

GLB7

　　(mg/L)

PKA總活性(nmol/min?mg)

實驗組 對照組

10 288.14±11.81 81.32±7.45

20 377.19±13.38 80.07±5.47

40 442.71±13.45 80.84±9.41

80 489.25±19.28 79.89±11.26

160 537.74±21.25 87.04±10.37

　　與對照組比較：P＜0.013　討論

　　關于蛋白激酶的測定方法，目前國內(nèi)外一般采用32P-γ-ATP磷酸化組蛋白法測定PKA活力。雖然同位素法靈敏度高，但存在放射性污染，加之條件要求高，不易進行。以HPLC法測定PKA的活性，不僅避免了同位素污染，而且方法簡便、重現(xiàn)性好(RSD=0.18%)、準確性及靈敏度高(回收率99.63%)。其測定原理是：ATP在PKA反應體系中作為提供磷酸的物質(zhì)，使底物磷酸化，同時降解為ADP和(或)AMP，其中ATP的消耗量與PKA之活力成正比。

　　蛋白激酶是催化體內(nèi)蛋白磷酸化的酶類，而蛋白磷酸化則是體內(nèi)各種生物反應最終起作用的通路。PKA是一類cAMP依賴性蛋白激酶，是整個cAMP作用的分子基礎，在真核細胞內(nèi)幾乎所有cAMP的作用都是通過活化PKA，從而使底物蛋白發(fā)生磷酸化而實現(xiàn)。本實驗證明靈芝多糖可引起小鼠腹腔巨噬細胞PKA活性明顯升高，提示其免疫增強作用可能與活化PKA有關。但其活化途徑仍需進一步研究。

　　Add ress: Li Mingchun, Department of Pharmacy, No.401 Hospital of PLA, Qingda o

　　國家自然科學基金資助項目　No/39400165

　　李明春　男，副主任藥師。1987年畢業(yè)于第二軍醫(yī)大學藥學系，獲學士學位：1998年畢業(yè)于 第一軍醫(yī)大學，獲藥理學碩士學位，研究方向為免疫藥理。近年來在國內(nèi)外期刊上發(fā)表論文 10余篇，獲軍隊科技成果獎6項。現(xiàn)主要從事臨床藥理學研究工作。?

參 考 文 獻

　　1，林志彬.北京醫(yī)科大學學報，1992，24(4)：271

　　2，雷林生，等.基礎與臨床，1992，12(2)：59

　　3，Lei L S, et al. Acta Pharmaceutical Sinica, 1992,27(5):331

　　4，Lei L S, et al. J Beijing Med Univ, 1991, 23(4):329

　　5，李榮芷，等.北京醫(yī)科大學學報，1991，23(6)：473

　　6，何慶云，等.北京醫(yī)科大學學報，1989，21(3)：225

　　7，鄂　征主編.組織培養(yǎng)技術.北京：人民衛(wèi)生出版社，1993：185

　　8，李明春，等.中國生化藥物雜志，1999，20(5)：233