《食用菌學(xué)報(bào)》 2007年第02期　作者：雷 萍 孫悅迎 張文雋 張 慧
　　以新鮮野生桑黃子實(shí)體為材料，采用組織分離法獲得純菌株。該菌株的培養(yǎng)特性研究結(jié)果表明，桑黃菌絲生長(zhǎng)的最適溫度為28 ℃，最適pH為6.5，最適碳源是葡萄糖，最適氮源是蛋白胨，最適栽培培養(yǎng)基是鮮桑樹(shù)枝木段培養(yǎng)基。
　　桑黃；A菌種分離；A生物學(xué)特性；A人工栽培
　　Q949.32； S567.301A
　　桑黃屬擔(dān)子菌亞門(mén)（Basidiomycotina）,層菌綱（Hymenomycetes）,非褶菌目(Aphyllophorales), 銹革孔菌科（Hymenochaeyaceae）,針層孔菌屬(Phellinus)，是火木層孔菌(P. igniarius)， 鮑氏針層孔菌(P. baumii)和裂蹄針層孔菌(P. linteus)的俗稱（商品名），生長(zhǎng)于楊、桑、柳、白樺、櫸和桃等闊葉樹(shù)的枯立木、立木及樹(shù)干上[1]。桑黃初期像一塊黃土，經(jīng)過(guò)一段時(shí)間的生長(zhǎng)，樣子像樹(shù)樁上伸出的舌頭[2]。子實(shí)體多年生，側(cè)生無(wú)柄，硬木質(zhì)、蹄形、扁半球形或不規(guī)則形，蓋面淺肝褐色至灰褐色或黑色，初時(shí)有細(xì)絨毛，老后常有明顯的縱橫龜裂，有同心環(huán)棱，邊緣鈍，有黃色翻邊，菌肉蛋黃色或淺咖啡色，木質(zhì)，菌管多層，層次不明顯[3]。桑黃因其寄生樹(shù)種不同，其形狀、顏色及含有的成分亦不同。目前，市場(chǎng)上銷(xiāo)售的桑黃有桑樹(shù)桑黃、松樹(shù)桑黃、楊樹(shù)桑黃和白樺桑黃等，其中桑樹(shù)桑黃為極品，價(jià)格最高。
　　桑黃是一種珍貴的藥用真菌[3-5]，有“森林黃金”之美稱。《中藥大辭典》記載，子實(shí)體入藥，可治血崩、血淋、帶下和閉經(jīng)等婦科疾病[6]，其抗菌、抗癌、抗纖維化和抗氧化等效果也很顯著，因而成為國(guó)際研究領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，特別是日本和韓國(guó)，對(duì)其進(jìn)行了廣泛深入的研究。由于桑黃價(jià)格昂貴及供不應(yīng)求，必然導(dǎo)致人們對(duì)桑黃菌的無(wú)序采集，加上桑黃菌本身生理生態(tài)的特殊性和復(fù)雜性，以及外部條件的制約，自然界中形成的桑黃子實(shí)體非常稀少，使得天然桑黃資源匱乏，面臨枯竭。由于桑黃的生長(zhǎng)周期相當(dāng)長(zhǎng)，要長(zhǎng)成適合藥用的大小，需要20~30年的時(shí)間，所以對(duì)其進(jìn)行人工栽培非常重要。本文擬通過(guò)分離野生桑黃純種，對(duì)其培養(yǎng)特性進(jìn)行研究，為實(shí)現(xiàn)桑黃人工栽培和商品化、規(guī)?；耘啵瑫r(shí)也為桑黃發(fā)酵產(chǎn)品及其制劑生產(chǎn)做一些基礎(chǔ)工作。
　　 1 材料與方法
　　 1.1材料
　　 1.1.1桑黃
　　桑黃子實(shí)體采自陜西省寧陜縣自然保護(hù)區(qū)海拔約1800 m左右的樺樹(shù)枯木上。選尚未木質(zhì)化、無(wú)任何破損的子實(shí)體，用紙包好帶回實(shí)驗(yàn)室。
　　1.1.2分離培養(yǎng)基
　　加富PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，蛋白胨5 g，KH2PO3 1 g，MgSO4 0.5 g，維生素B110 mg，瓊脂20 g，蒸餾水1000 mL，pH自然。  
        1.2.3碳源測(cè)定基礎(chǔ)培養(yǎng)基
　　蛋白胨5g，KH2PO41 g，MgSO40.5 g，維生素B110 mg，瓊脂20 g，蒸餾水1000 mL，pH自然。
　　1.2.4氮源測(cè)定基礎(chǔ)培養(yǎng)基
　　葡萄糖20 g，KH2PO41 g，MgSO40.5 g，維生素B110 mg, 瓊脂20 g，蒸餾水1000 mL，pH自然。
　　1.1.5栽培培養(yǎng)基
　　桑樹(shù)鋸木屑培養(yǎng)基：桑樹(shù)鋸木屑100%，含水量60%~62%。將新鮮無(wú)雜質(zhì)的桑樹(shù)鋸木屑按比例加水，混合均勻至用手輕輕捏成團(tuán)、指縫間有水而不流、觸之即散，然后裝入500 mL廣口瓶，每瓶裝干料150 g，瓶口用兩層薄紙外加一層防潮塑料扎好，0.1 MPa滅菌2 h。
　　 鮮桑樹(shù)枝木段培養(yǎng)基：取直徑3~5 cm的新鮮桑樹(shù)枝，鋸成4 cm長(zhǎng)的木段，每條劈兩塊，裝入廣口瓶（瓶口直徑7.5 cm，高12 cm），每瓶裝12塊，瓶口同樣用兩層薄紙外加一層防潮塑料扎好，0.1 MPa滅菌2 h。
　　1.2方法
　　1.2.1桑黃子實(shí)體處理
　　 取新鮮桑黃子實(shí)體，用干凈刷子刷去菇體表面的雜質(zhì)，用75%的酒精擦洗固體外表面5次進(jìn)行消毒，然后置于無(wú)菌燒杯中備用。
　　1.2.2桑黃組織分離法
　　將已處理消毒好的子實(shí)體在超凈工作臺(tái)上撕開(kāi)，用已滅菌的解剖刀在菌片中央切取米粒大的組織1塊，放入無(wú)菌平板培養(yǎng)皿表面，倒置于25 ℃恒溫箱中培養(yǎng)。待長(zhǎng)出菌絲后，取生長(zhǎng)快、菌絲長(zhǎng)的菌絲塊，移入另一無(wú)菌平板培養(yǎng)皿表面培養(yǎng)，待長(zhǎng)出菌絲后，取生長(zhǎng)快、無(wú)雜菌污染的菌絲塊，移入斜面培養(yǎng)基表面，25 ℃培養(yǎng)12 d、菌絲長(zhǎng)滿斜面且無(wú)雜菌，即為桑黃菌母種。
　　1.3野生桑黃菌人工培養(yǎng)條件的研究
　　1.3.1溫度試驗(yàn)
　　試驗(yàn)選用加富PDA培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，設(shè)13、18、23、28、33和38 ℃ 6 個(gè)溫度處理，每個(gè)處理重復(fù)5次。接入組織分離的桑黃菌種，培養(yǎng)6 d，以平板培養(yǎng)基上菌絲生長(zhǎng)速度作為菌絲生長(zhǎng)量指標(biāo)，取其平均值，比較不同溫度對(duì)桑黃菌絲生長(zhǎng)的影響（接種塊萌發(fā)快慢、菌絲生長(zhǎng)快慢都影響試驗(yàn)結(jié)果，因此在菌種萌發(fā)后長(zhǎng)出1 cm左右畫(huà)起始線，快長(zhǎng)滿培養(yǎng)皿時(shí)畫(huà)終止線，兩線之間的距離除以天數(shù)，即為生長(zhǎng)速度cm/d, 下同）。
　　1.3.2pH試驗(yàn)
　　試驗(yàn)選用加富PDA培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，用0.1 mol/L NaOH和0.1 mol/L HCI將培養(yǎng)基pH分別調(diào)節(jié)到5.5、6.0、6.5、7.0和7.5五 個(gè)不同的處理，每個(gè)處理重復(fù)5次。接種桑黃母種，28 ℃培養(yǎng)6 d，以平板培養(yǎng)基上菌絲生長(zhǎng)速度作為菌絲生長(zhǎng)量指標(biāo)，取其平均值，比較不同pH對(duì)桑黃菌絲生長(zhǎng)的影響。
        1.3.3碳源試驗(yàn)
　　碳源測(cè)定基礎(chǔ)培養(yǎng)基5份，分別添加2%的蔗糖、2%的可溶性淀粉、2%的葡萄糖、2%玉米粉和2%的麥芽糖。每個(gè)培養(yǎng)皿內(nèi)分別加入20 mL培養(yǎng)基，每組由5個(gè)平板組成。將桑黃菌種接入制備好的平板中， 28 ℃培養(yǎng)6 d，以平板培養(yǎng)基上菌絲生長(zhǎng)速度作為菌絲生長(zhǎng)量指標(biāo)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次，取其平均值，比較不同碳源對(duì)桑黃菌絲生長(zhǎng)的影響。
　　1.3.4氮源試驗(yàn)
　　氮源測(cè)定基礎(chǔ)培養(yǎng)基5份，分別添加0.5%的蛋白胨、0.5%的（NH4）2SO4、0.5%的NH4NO3、0.5%的牛肉浸膏和0.5%的酵母膏。每個(gè)培養(yǎng)皿內(nèi)分別加入20 mL培養(yǎng)基，每組由5個(gè)平板組成。將桑黃菌種接入制備好的平板中，28 ℃培養(yǎng)6 d，以平板培養(yǎng)基上菌絲生長(zhǎng)速度作為菌絲生長(zhǎng)量指標(biāo)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次，取其平均值，比較不同氮源對(duì)桑黃菌絲生長(zhǎng)的影響。
　　1.3.5桑樹(shù)鋸木屑和鮮桑樹(shù)枝木段培養(yǎng)基栽培試驗(yàn)
　　將桑黃母種分別接種在桑樹(shù)鋸木屑培養(yǎng)基內(nèi)或鮮桑樹(shù)枝木段條塊表面，28 ℃培養(yǎng)45 d，每天記錄桑黃菌絲生長(zhǎng)情況, 測(cè)定不同栽培培養(yǎng)基對(duì)桑黃菌絲生長(zhǎng)的影響。
　　 2 結(jié)果與討論
　　 2.1野生桑黃的培養(yǎng)特性
　　 2.1.1菌絲生長(zhǎng)特性
　　菌絲生長(zhǎng)慢，2周內(nèi)覆蓋平板。生長(zhǎng)新區(qū)鋸齒狀，白色，輕微升起的氣生菌絲延伸到生長(zhǎng)區(qū)的邊緣。菌落白色至微帶奶油色、黃褐色、蜜黃色。邊緣絨毛狀，較老的部位為棉花狀和羊毛狀、氈狀。生長(zhǎng)新區(qū)反面無(wú)變化，老區(qū)反面奶油黃色到黃褐色。
　　2.1.2菌絲特征
　　生長(zhǎng)新區(qū)的菌絲薄壁，透明，有一主干，呈樹(shù)枝狀分枝，具不明顯的簡(jiǎn)單分隔，直徑3.0~6.0 μm。氣生菌絲如生長(zhǎng)新區(qū)的菌絲，纖維菌絲或多或少具加厚的壁，微綠色至黃色到褐色，稀少分枝，不分隔，直徑1.0~3.0 μm，菌絲上具連續(xù)的不規(guī)則膨大的表皮細(xì)胞，念珠狀，薄壁，偶爾呈直角分枝，內(nèi)含物豐富，直徑5.0~7.0 μm。基內(nèi)生菌絲如生長(zhǎng)新區(qū)的菌絲。
　　本文原文
　　2.2野生桑黃菌人工培養(yǎng)條件研究結(jié)果
　　2.2.1溫度對(duì)桑黃菌絲生長(zhǎng)的影響
　　桑黃菌絲對(duì)溫度的變化很敏感，菌絲生長(zhǎng)速度隨溫度的升高而加快，28 ℃時(shí)最快，隨后又逐漸降低（表1）。從表1可以看到，桑黃菌絲在13~38 ℃的范圍內(nèi)均能生長(zhǎng)，最適生長(zhǎng)溫度為28 ℃。
　　 1）表中數(shù)據(jù)為5次重復(fù)的平均值
　　Data shown represent the average of 5 replicates
　　2）“+++”表示菌絲生長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)，“++”表示菌絲生長(zhǎng)勢(shì)一般，“+”表示菌絲生長(zhǎng)勢(shì)弱
　　“+++” Vigorous mycelial growth,“++” moderate mycelial growth,“+”weak mycelial growth 
    　1）表中數(shù)據(jù)為5次重復(fù)的平均值
　　Data shown represent the average of 5 replicates
　　2）“+++”表示菌絲生長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)，“++”表示菌絲生長(zhǎng)勢(shì)一般，“+”表示菌絲生長(zhǎng)勢(shì)弱
　　“+++” Vigorous mycelial growth,“++” moderate mycelial growth,“+”weak mycelial growth
　　 2.2.2pH 對(duì)桑黃菌絲生長(zhǎng)的影響
　　不同pH對(duì)桑黃菌絲生長(zhǎng)的影響見(jiàn)表2。從表2可以看到，桑黃菌絲在pH5.5~7.5的范圍內(nèi)均能生長(zhǎng)，最佳pH是6.5。
　　2.2.3碳源對(duì)桑黃菌絲生長(zhǎng)的影響
　　不同碳源對(duì)桑黃菌絲生長(zhǎng)的影響見(jiàn)表3。從表3可以看到，桑黃菌絲在供試的5種培養(yǎng)基上均可生長(zhǎng)，但在添加葡萄糖的母種培養(yǎng)基上菌絲濃密健壯，生長(zhǎng)勢(shì)旺盛；在添加麥芽糖的母種培養(yǎng)基上生長(zhǎng)勢(shì)最弱。因此，桑黃菌絲生長(zhǎng)的最佳碳源是葡萄糖。
　　2.2.4氮源對(duì)桑黃菌絲生長(zhǎng)的影響
　　不同氮源對(duì)桑黃菌絲生長(zhǎng)的影響見(jiàn)表4。從表4可以看到，桑黃在供試的5種氮源培養(yǎng)基上均可生長(zhǎng)，但在以蛋白胨為氮源的培養(yǎng)基上菌絲生長(zhǎng)速度最快，且菌絲濃密健壯，生長(zhǎng)勢(shì)旺盛；在以酵母膏為氮源的培養(yǎng)基上菌絲生長(zhǎng)勢(shì)最弱。因此，桑黃菌絲生長(zhǎng)的最適氮源是蛋白胨。
　　2.2.5桑樹(shù)鋸木屑和鮮桑樹(shù)枝木段對(duì)桑黃菌絲生長(zhǎng)的影響
　　桑黃菌絲在兩種不同培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)見(jiàn)表5。從表5可以看到, 在鮮桑樹(shù)枝木段培養(yǎng)基上桑黃菌絲生長(zhǎng)良好，雖然菌絲長(zhǎng)滿瓶時(shí)間較晚, 但菌蕾出現(xiàn)早(菌蕾初期如拇指大小，扁半球形或馬蹄形，1.5×3.0 cm，厚0.5~1.0 cm，淺肝褐色至暗灰色，有同心環(huán)棱，邊緣鈍)；在桑樹(shù)鋸木屑培養(yǎng)基上桑黃菌絲生長(zhǎng)速度快，菌絲滿瓶早，但菌蕾出現(xiàn)晚。由此可見(jiàn), 鮮桑樹(shù)枝木段是桑黃菌絲人工栽培的最佳培養(yǎng)基。
　　 3 討論
　　 3.1A試驗(yàn)結(jié)果表明，桑黃菌絲生長(zhǎng)的最適溫度為28 ℃；最適pH為6.5；最適碳源是葡萄糖；最適氮源是蛋白胨；最適栽培培養(yǎng)基為鮮桑樹(shù)枝木段培養(yǎng)基。本研究為桑黃菌種生產(chǎn)、菌絲體發(fā)酵及子實(shí)體人工栽培培養(yǎng)基配方和條件的確定提供了參考。
　　3.2A采用桑樹(shù)鋸木屑和鮮桑樹(shù)枝木段作培養(yǎng)基對(duì)桑黃菌進(jìn)行模擬野生生態(tài)條件培養(yǎng)，可促使人工培養(yǎng)桑黃長(zhǎng)出菌蕾，但子實(shí)體生長(zhǎng)不正常，其機(jī)理尚有待于進(jìn)一步的研究。
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　　 宋鳳菊
　　Growth characteristics of Vegetative Mycelium Isolated from WildPhellinusfruit Bodies
　　LEI Ping,SUN Yueying，ZHANG Wenjun，ZHANG Hui
　　Shanxi Institute of Microbiology，Xi’an，ShanxiA710043，China
　　Vegetative mycelium was isolated from tissue of fresh fruit body ofPhellinuscollected from the wild and the effects of various culture parameters on mycelial growth were determined. Optimal temperature and pH value for mycelial growth were 28 ℃ and 6.5, respectively while, of a number of carbon and nitrogen source tested, glucose and peptone respectively supported the highest mycelial growth rates and most vigorous mycelium production. Fresh-cut mulberry logs were superior to mulberry wood sawdust for the artificial cultivation of thePhellinusstrains.
　　Phellinus;AStrain isolation;ABiological characteristic;AArtifical cultivation